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实验小技巧-丁香园

发布时间:2015-03-18 15:55:11

抗体

做单抗在融合过程中一定要使用无血清的培养基,因为融合中用到的PEG可以使血清中的一些蛋白发生沉淀而导致培养孔中的一些沉渣的出现,这些渣子对任何细胞的培养都是不利的。
 

同时跑2块胶,同时转膜,然后两块膜背靠背放入同一封口膜同时封闭,同时一抗二抗(最好是用转轮,这样效果好.如果是摇床,隔一段时间帮它们翻个身以保证两张膜的正面都有机会与液体充分接触.一起洗膜(可以稍微加强洗膜也可以不做.我最多一张盘子里放4张膜而没有影响洗膜).可分别或同时压片.这样就可以节约一半抗体和接近一半时间而不会影响结果.
 

或者另外一个就是孵育后的抗体不要扔,好的抗体可以反复做好几张膜呢.但每次都会减弱,效果不如上面一种方法.

 


转化

有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大(1~2毫米以上,BL21就长得快),下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔(勿带出培养基),50微升酚/氯仿悬浮菌体,放置两分钟,加40微升TE抽提,上层TE吸出后再氯仿抽提一次,吸取上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作,可以省去转接液体试管的培养步骤,至少节省6~8小时的时间。但是,要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果,不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复-
 

转化时一定要做一个宿主菌的对照,即重组质粒涂板后再用宿主菌涂响应抗性的平板,以确定第二天长出来的克隆是否正确,我当时做了三次转化之后才发现不成功竟然是由于BL21可以在Amp(+)的平板上面生长。

 

 

PCR

平行作不同样本的PCR,模板DNA加量一样,配置PCR体系可以一起配制后分装----这点做过试验的都知道,但是配制的时候配制量可以比预期分装量稍多一点(如用100微升则配110微升),这样可以避免有时候分装不够的尴尬,因为不同特别是大小不同的枪,会有误差。

SDA-PAGE
sds-page胶预配(APS和TEMED、或者后者先不加)的问题,实际上时间放置过长肯定影响效果,如果要在一天内连续地跑两次板,何尝不可?又比如,配sds-page胶的时候,上层胶和下层胶可以只用一个大枪头:先取胶,次取水,取6.8的tris后再取8.8的tris,省时省料。
 

做SDS-PAGE跑胶通常都是现配现用,但配胶要>1h,所以如果想第二天睡个懒觉而又不耽误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分离胶,待凝聚后不要拔下梳子,把含胶玻璃板从制胶槽取下,用保鲜膜包上,注意玻璃板上下两边缘会有气体,所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发.然后放4度过夜.第二天直接拔下梳子行后续.国外好多公司出售脚既是如此,可以保存上星期.
 

配置分离胶或者非变性胶时因胶凝时收缩可导致加样孔变浅.可以将加剩的胶放入4度以降低凝聚速度,而将凝胶放入37度促聚,并随时用4度加剩的胶补充下降的胶面.另外将胶横放与水平面成~10度角也可以减少收缩的影响.

 

 

蛋白透析

蛋白透析的时候透析液的PH值很重要。除PH值外,做透析操作的时候一定要带手套,手上的一些油脂对透析袋的通透性以及整个透析的效果有很坏的影响。
 

蛋白透析时出现沉淀总是不可避免的,但是要想尽办法将沉淀降到最低。导致沉淀出现的主要原因就是PH值了。建议透析前先查一查自己目的蛋白的等电点然后在确定透析液的PH值,而且PH值最好是离蛋白等电点远一点,一次透析可以配制3个不同PH值的透析液,这样根据沉淀的多少确定最佳透析PH值,这样可以节省一点时间和精力。

 


酶切

如果是要做酶切,提质粒的最后一步最好是用水溶解DNA,因为TE里面的离子会影响酶切的效率。

 

蛋白表达

当蛋白大量的表达时,包含体的形成几乎是不可避免的,而且很难通过改变一些诱导条件来改变,最有效的办法就是换表达系统,所以如果时间还充分的话,可以尝试一下,如果时间较短了,还是安心的座包含体蛋白的处理算了,而且变性之后的蛋白通过一些方法复性率也可以达到60%以上。


质粒提取
小提质粒:将amp浓度提高到200ug/ml,下班前接种,次日一早收获菌体,此时OD虽然不高,质粒丰度却不一般!!菌体量少些,操作体积(管数)也小(少)。

2,  质粒酶切:双酶切制备克隆插入片段的载体,最好选择带有外源片段的质粒,是否酶切完全,从电泳条带的分子量上可以比较明确地判断。空质粒单切完全和双切完全在分子量上差异不大。

3,  Tricine电泳做起来比较麻烦,有时试剂也不凑手。15%的SDS-PAGE用2X Tris-Gly 缓冲液跑,9~14KD的小蛋白分离效果也非常好。

4,  没有ACTA Express的实验室,做蛋白层析纯化,采用医院输液的瓶子和输液软管,调整瓶子的高度和软管上的卡子,可以方便地控制流速。采用买来的注射用水(500ml/瓶)配制溶液(可以灭菌或超滤),还能较好地在普通实验室控制外源热源质的污染。(以上两条记得在我另外的帖子里也顺便提到过)

5,  我们原先实验室的PCR仪中,存有一个“懒汉”程序。94度40秒/63度90秒,专门用于从已知序列和丰度的模板(如质粒)上扩增500bp以下的片断。当然事先还得知道引物的Tm是否适合在63度复性。

6,  用大离心机(非台式),比如大提质粒、大量提取包含体、离心蛋白溶液,可以比“分子克隆”上要求的时间稍短一些,因为大转子启动和停止的时间比较长。

7,  做等点聚焦电泳,胶浓度低容易破碎,剥胶时可以将其放在装有纯水的大培养皿内操作。

 

手提质粒,如果用氛氯仿和氯仿两步抽提,再注意一下手法,严格按照参考书上面的操作的话,提出的质粒不比任何质粒提取试剂盒差,我感觉好像还好一点,我就用过一次试剂盒,比较了之后不如我手提的好,以后再也没用过了。

 

在实验室,我手提质粒最快,大概12管菌30分钟可以做上酶切。说下我的步骤:倒菌,离心一分钟后加bufferI,II和III,这些都一样,加好III后离心最大速8分钟。倒出上清于新管,加1毫升100%酒精混匀后离心最大速5分钟,倒出酒精70%酒精1毫升2分钟离心,倒去后枪头吸干加水融质粒(在离心的时候可以配酶切体系)。这种方法适用于小提鉴定质粒。很好用。绝对省时,可以保证这是手提质粒最快的方法了!

 

 

Western blor

 

做western blotting 转膜时,胶放在转膜缓冲液中一段时间,待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装 好转膜装置,我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染maker条带,方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker很清楚,等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染maker后就不要使胶和膜发生对位移动了,以防maker失去参照价值。

 

1)器具的清洁非常重要,开始做前,为了安全,尤其是装胶的厚薄玻璃板,可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗,确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗2-3遍,然后用去离子水冲洗一遍。最后用95%酒精再擦一遍后晾干备用。
 

2)配胶最好现用现配,先配下层胶(分离胶),后配上层胶(浓缩胶或积层胶),而且在临灌胶前加APS并迅速混匀,即用移液枪抽吸与注入1-2次即可。

 

通用技巧

使用离心机时如果有多个离心管同时离,我一定要按照离心管的编号从离心机的1号离心槽开始装起,曾经一次离心时EP管的盖子离掉,这个习惯帮了我的忙。这个习惯的形成来自于一次离心时离心管和配平管都未标记,结果离完后分不出谁是谁非了。
 

试验中加液时对于一些易出错的地方也养成一些习惯,如PCR时总是先加up引物,再加down引物,双酶切时先加B开头的酶,再加E开头的酶,不会因一时分心忘记了哪个加了哪个没加。

 

在实验中我们配制溶液的时候难免会遇到一些对身体有害的化学药品或制剂,这时为尽量少接触有毒物质,称量时记下克数,按照这个质量计算相应要加的液体,可以避免在天平上反复的添减.另外,为了少污染量筒或量杯,配制这类有毒性的药品时,,比如要配制200ml溶液,可以事先用量筒精确量出200ml蒸馏水倒入刻度瓶,然后在瓶外画上记号,倒出水,将秤好的药品直接倒入刻度瓶,添加水到记号处就OK了,这样就省着刷洗量筒了,呵呵

 

蛋白质与小分子相互作用

曾经做蛋白质与小分子的相互作用,因为蛋白是同位素标记的,非常昂贵,所以需要回收。刚开始一直用浓缩杯不断的浓缩交换buffer,因为小分子是有颜色的,所以就根据颜色的变化,希望可以不断浓缩,添加buffer,从而去掉小分子也尝试了,透析。但是感觉操作起来非常的麻烦,因为要浓缩好久。对蛋白也有损失。我于是就想了办法,重新走了一遍离子柱,将蛋白上样到Q柱上,然后不断的用buffer冲柱子,这样一次就把蛋白回收了,而且小分子也去的非常彻底。

 

 

我们实验室的电泳仪年头久了,制胶板的垫子铺不平等种种原因,导致胶总是缓慢的渗漏,我从一位老师处学来用胶封底,很好用。

封底胶:

水800ul

30%或40%的丙烯酰胺 800ul

10%APS 40-50ul

TEMED 8ul

加好TEMED后,迅速混匀,用枪一面加700或800ul,不出1-2分钟,肯定凝。

然后,再依次加分离胶和积层胶。

不影响电泳,和蛋白的移动,我试过N次。

 

不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上, 转移效率低怎么样解决?

可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液,可以参考《蛋白质技术手册》),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用小孔径的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交联;低浓度胶,如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间。

 

能导致PAGE胶不凝的原因主要有三个:

1、配胶中用到的主要试剂的配置。

主要就是30%的丙稀酰胺的配置。 粉末状的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不应该超过一年,因为丙稀酰胺会吸潮水解,这样以来丙烯酸的含量就会加大,从而导致page胶不凝。

2、温度。

温度高时凝固快,但是亦不宜过高,因为温度变化会影响交连物的孔径大小。所以温度在25度最为合适。

3、氧气。

氧气是凝固的终止剂,所以不能让胶中出现气泡。

虽然都是些看起来听低级的错误,但是不注意还是会犯。

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我做2维蛋白电泳,也有些心得:

1、向电泳玻璃板内加入胶条时,先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液,要加满,再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘,这样可以很好的避免胶条下形成空气泡。

2、 能做出好的图谱已经很不容易了,如果在扫图时撕破实在可惜,所以扫图要小心,将凝胶转移到扫描仪时可以用塑料隔片在下面托着,同时保持有些水,这样就安全多了。



蛋白修饰

我是做蛋白修饰巯基后,通过这两种方法的定量来间接反应修饰的程度。一路摸索过来,也有半年有余;最大的体会就是不要急于求成,直接实验,首先检测修饰体系是否对方法有影响,修饰基团是否会在595nm和412nm下有特定的吸收,修饰后修饰试剂本身是否会有变化,对蛋白整体结构造成影响,其次再谈具体修饰比例和程度。对于巯基浓度测定方法,有四种(Anal Biochem. 1998 Dec 1;265(1):8-14),而DTNB本身虽然灵敏度不高,但是重复性和抗干扰是最佳的了。

 

考马斯亮蓝染色后的脱色,如在脱色液中加数张捏成条状的Kimwipes纸(国外实验室常用,相当我们的擦镜纸,全棉纤维制造),由于染料吸附到纸纤维上,脱色加速。 待纸着色较深时,更换新纸条,不用换液。我想脱脂棉或纱布也是一样的。但滤纸等可能不行,会溶掉。

半贴壁细胞如SP/0或杂交瘤细胞传代时,不用吹打或刮落。先将上清吸出,适当拍打培养瓶(当然是塑料瓶,玻璃瓶拍碎了别找我),即可见贴壁细胞脱落,加培养基混悬即可。注意,过力拍打培养瓶会裂,特别是瓶颈。

 

 

 

我也推荐几条:

1、关于20021108战友的说法,我觉得我们制备好了一批感受态,最好马上转化一种已知质粒,与此同时,取一点感受态接种到含抗性的固/液体培养基培养来做对照。这样第二天即可以知道这批感受态是否还有外源质粒,又可以知道这批感受态转化效率的高低。如果合格,那以后就可以放心使用!因为我也曾经遇到其实是因为感受态不好而导致试验不成功,但是当时不知道,结果费时费力。

2、做克隆挑斑时,我们可以在将沾有菌体的牙签丢到试管前,在一块相应抗性的平板上点一下,标注清楚,培养时间稍长一点,待长成较大菌落后收取。以后需要哪一个菌,就在平板上挑取。这样既方便快捷,又可以保证菌的一致。

3、抽提质粒时,加入Sloution II和III后要求轻柔混匀。我个人觉得不用这样,只要不是非常剧烈,可以快速混匀。尤其可以运用在一次抽提多管质粒的时候,这样可以快速,而且效果一点也不差。

4、抽提质粒时,用无水乙醇沉淀的时间可以由实验操作者来决定,如果时间充裕可以30min,否则8-10min也可以。至于温度,个人觉得-20度好于常温。如果加入可醋酸钠,会较容易形成盐类杂质,所以时间短一些更好!

 

细胞培养

培养细胞应该是不陌生的,我这里谈一个培养细胞的小技巧,大家知道,对于一定的空间(如某种尺寸的细胞培养瓶)来说,细胞数目太多或者太少都不利于其生长,太多了就要消化,太少了要换一个小点儿的培养瓶,我的做法是:如果细胞数目太少,可以不必去找小一点儿的培养瓶,可把原来的培养瓶由原来的平放改为竖着放,这样底部的空间就小了,有利于细胞的生长,当细胞数目增加到一定程度的时候还可以在平过来,避免了来回换培养瓶而增加污染的机会(对没有小培养瓶的更实用)。

 

 

WB 经验2则

1、一般我们摸索抗体的工作浓度及反应条件都是采用点杂交,只需一块很小的膜,一般我们用膜的边角料,一般直接将蛋白点在膜上即可,每次2ul 然后烘干,反复点样大约8ul 左右即可,注意点样时,用枪头尖把蛋白向四周拔下,然后直接抗体孵育显色即可,抗体稀释液一般100ul 即可,这样即节省抗体,又节省膜。

2、另说一下我们实验室孵育抗体的方法:

告诉你一种较好的节省抗体的方法,我们一般用96或24孔板的盒盖用封口膜封住作为反应板,先铺约1ml抗体稀释液,用反贴法,膜正面向下,注意不能有气泡,可用胶铲或找个干净的试管在膜上滚动去除气泡,再加0.5 覆盖足够,还可以回收约1ml ,回收后的抗体有叠氮钠加0.2%,保存于-20度,可放时间长点,我最长1月用,效果尚可,没有的话直接放在4度,一般一周内使用没问题,我们一般重复1次使用,二抗建议不要重复使用,酶太容易失效了,再说二抗很便宜,别省这点钱。但要注意,要把反应板用另一个对称的96或24孔板盖子盖好,然后保鲜膜包好,并放在湿盒以防抗体挥发。

PS:1)建议大家可去收集做MTT 实验的同学或其他人的96或24孔板的盒盖,最好找到不同牌子的板子,这样更容易找到两块可以对称盖好的盒盖

2)封口膜大约150元一卷,做反应板时只要剪一半即可,封口时双手尽量将封口膜向四周拉,然后覆盖盒盖即可,一般我封3层,怕破嘛,哈,新手肯定要多练习,我刚开始时,用老大一块膜才封好一层,现在只要四分子一块即可。